低溫肉制品是指在常壓下通過(guò)蒸、煮、熏、烤等熱加工過(guò)程使肉制品的中心溫度控制在68～72 ℃，并且需要在0～4 ℃的低溫環(huán)境下貯藏、運(yùn)輸及銷售的一類肉制品。與高溫肉制品（通常采用121 ℃、0.1 MPa的高溫高壓加熱方式）相比，低溫肉制品能夠最大限度地保留肉類原有的營(yíng)養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)，是世界肉類產(chǎn)品的發(fā)展趨勢(shì)。低溫肉制品在蒸煮階段一般采用68～72 ℃的殺菌工藝，冷卻后在無(wú)菌車間進(jìn)行切分，真空包裝為此類肉制品的主要包裝形式，保質(zhì)期一般為2～4 周，保質(zhì)期的長(zhǎng)短主要取決于初始菌量及貯藏溫度。
本研究對(duì)真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進(jìn)行菌株的培養(yǎng)、分離與純化以及PCR擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA），并對(duì)菌株的生理生化特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步采取有效的防腐保鮮措施、延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期提供參考。
1、菌株的菌落特征及PCR鑒定結(jié)果
本研究分別采用涂布法和傾注法對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)樣品稀釋液在BHI培養(yǎng)基上所生長(zhǎng)細(xì)菌菌落的表型差異，共篩選出12 株腐敗菌，編號(hào)為n01～n12，12 株菌的基本形態(tài)特征如表1所示。菌株的分離和篩選主要依據(jù)其形態(tài)、顏色等特征，不排除篩選出同一種屬、甚至同一菌株的可能性。
所有菌株經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增（16S rDNA）后均出現(xiàn)了清晰可辯的特異性條帶，條帶大小為1 500 bp左右。其中菌株n01、n04、n05、n09、n10的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。
2、ARDRA結(jié)果
ARDRA是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）在核糖體DNA序列上的應(yīng)用。最初的RFLP技術(shù)的依據(jù)是不同生物個(gè)體之間DNA片段的酶切位點(diǎn)有所差異，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后能夠產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，基于對(duì)限制性片段的分析，從DNA水平比較不同個(gè)體之間的差異。ARDRA則是根據(jù)16S rDNA基因序列的限制性片段區(qū)分菌株種的差異。
12 株菌的16S rDNA分別經(jīng)EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切、TaqⅠ單酶切后，均可獲得便于區(qū)分的酶切圖譜。根據(jù)條帶的相似性可以將12 株菌分為5 組，第1組包括n01、n02、n03和n08，第2組包括n05、n06和n07，第3組包括n09和n11，第4組包括n10和n12，第5組僅包括n04。同一組內(nèi)菌株的酶切圖譜具有較高的相似性，表明這些菌株之間存在一定的親緣關(guān)系。
3、菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
n01和n08與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、n02與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、n03與特基拉桿菌（Bacillus tequilensis）親緣關(guān)系最近，它們均屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）；n04與嗜冷桿菌屬（Psychrobactersp.）親緣關(guān)系最近；n05、n06和n07與魏斯氏菌屬（Weissellasp.）親緣關(guān)系最近；n09和n11與鏈球菌屬（Streptococcussp.）親緣關(guān)系最近；n10和n12與腸球菌屬（Enterococcussp.）親緣關(guān)系最近。
4、菌株的生理生化鑒定結(jié)果
參照GenBank比對(duì)結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行相應(yīng)的生理生化鑒定。由表2可知，n01和n08為枯草芽孢桿菌，n02為解淀粉芽孢桿菌，n03為特基拉芽孢桿菌，n04為嗜冷桿菌屬的Psychrobacter urativorans（暫無(wú)中文命名），n05、n06和n07為魏斯氏菌屬中的綠色魏斯氏菌，n09和n11為巴黎鏈球菌，n10和n12為糞腸球菌。
結(jié)論
本研究對(duì)真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進(jìn)行分離，并結(jié)合表型分析、ARDRA、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，分離得到的12 株菌中，4 株為芽孢桿菌屬，3 株為綠色魏斯氏菌，2 株為巴黎鏈球菌，2 株為糞腸球菌，1 株為嗜冷桿菌。其中，綠色魏斯氏菌是導(dǎo)致樣品變綠的主要原因，總體來(lái)說(shuō)，乳酸菌是真空包裝低溫熟肉制品中的主要腐敗菌。本研究為進(jìn)一步采取有效的防腐保鮮措施、延長(zhǎng)低溫肉制品的貨架期提供了理論依據(jù)。
